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实验专栏丨划重点!质粒转化不用愁!

实验专栏丨划重点!质粒转化不用愁!

时间:2021年06月01日 22:17:30 来源:www.whykang.com 阅读:

  实验专栏丨划重点!质粒转化不用愁!,下面是本站编辑关于实验专栏丨划重点!质粒转化不用愁!的详情解说:

昨天在推文中讲述了分子克隆的有关酶切,切还是不切?

  切过了头咋办?

  (文末有福利)的问题,那么在分子克隆实验中还有有关质粒的问题是实验研究的必备技能之一。

  今天中洪君与大家就好好说道说道质粒的转化——

质粒转化原理

质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。

  将连接产物转化到感受态细胞中,实现重组克隆的增殖,便于后续分子操作。

  可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。

  实验目的是掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。

质粒常规转化实验方法与步骤

1、取一个1.5ml离心管,加入50μl感受态细胞悬液,置冰上。

  加入50-100ug质粒,用移液器轻柔混匀。

  冰上静置20min。

2、将EP管先放于42℃水浴中热激30-40秒,然后迅速置冰上3~5min。

  整个过程不要振荡菌液。

3、加入500ul LB液体培养基(一定不含抗生素),混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

4、制备含有Amp抗生素的LB平板。

5、取100ul菌液,将液体滴加至含有抗生素Amp的LB固体培养基平板上,用三角玻璃棒均匀涂抹。

6、37℃培养箱内正置15分钟, 待菌液被培养基吸收后,37℃倒置培养12~16小时,次日可见均匀分布的阳性克隆。

  挑取单克隆菌落后,送公司测序,验证是否为阳性筛选质粒。

  或者直接挑取菌落后,加至含有抗生素的液体LB肉汤中摇菌,获得大量菌液后提取质粒。

目前市面上也有一些快速转化感受态细胞。

  转化过程不需要冰浴、热敷和孵育等步骤,比如有些感受态细胞实现了五分钟转化:

1. 取一个1.5ml离心管,加入50μl感受态细胞悬液,置冰上2分钟。

2. 42度热激30s。

3. 置冰上2分钟。

4. 加入200ulLB液体培养基后,均匀涂抹于37度预热的抗生素LB固体平板。

  注意,此时LB固体平板一定要先放于37度培养箱中预热。

扩培需要大提质粒的大肠杆菌菌种,根据质粒的抗性加入相应的抗生素

(中洪实验室实操图)

注意事项:

1. 感受态可用灭菌的离心管分装使用。

2. 根据需要在第5步骤时将转化液6000rpm离心3min,然后只留下100μl左右的上清液,混匀沉淀,全部加入相对应的平板中。

3. 转化过程在超净工作台中进行。

转化失败案例解答:

Q:我们做了转化,1ul的质粒加入4ulM水,取1.5ul进入感受态细胞,1mlLB培养基,涂了2个板子,结果没长一个菌,应该是能长出来了,步骤的话就是加入感受态后冰浴30min多冰了5min,热激后冰浴5min又多冰了3、4min,然后就没有什么地方出错了,质粒是别的实验室寄过来的,好的。

  不知道啥原因,请教下转化失败的可能原因有哪些?

这一批感受态还不错,有人做了别的挺好,热激很注意的,没问题,是热激后迅速冷却那儿冰久了点 ,无抗的LB复苏了50min,纠结啊~

A:质粒转化一般是没啥问题的。

  但是结果你杯具了。

  我总结几个原因:

1.热击标准时间是60-90s,你注意下你是不是热击超时;

2.感受态细胞的问题,感受态是否保存时间过长效率降低;

  同时,感受态最高的转化效率在解冻的短时间内。

  你要注意你是否没有在解冻的短时间内加入需转化质粒;

3.质粒抗性原因,要搞清楚你的质粒是什么抗性,是amp还是kana?

  涂错了板子你就彻底杯具了;

4.有的感受态不是很猛,你转化进去的质粒不能很快使细菌表现出抗性。

  你迅速涂板子,你就杯具了。

  有时候要用无抗的LB培养基复苏一下细菌,一般30-60min。

——————中洪博元部分实验展示——————

  以上就是关于“实验专栏丨划重点!质粒转化不用愁!”的介绍。

责任编辑:褚兴英

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